توسعه سيستم هاي آزمايشگاهي، جهت انجام فرآيند اسپرمزايي و توليد اسپرم در خارج از بدن موجود، براي مطالعات بنيادي و كاربردي در حيطه هاي پزشكي (مطالعات و درمان ناباروري)، بيوتكنولوژي (توليد حيوانات تراريخت) و كشف داروها اهميت بسيار بالايي دارد. در اين اختراع، با استفاده از سيستم سه بعدي آگار نرم (SACS)، شرايط كشت آزمايشگاهي فراهم آورده شده است، كه ظرفيت القاء تمايز سلول هاي ژرمي جوجه به مراحل نهايي فرآيند اسپرمزايي و توليد اسپرم را دارد. سلول هاي بافت بيضه جوجه تازه متولد شده، جدا و كشت داده شدند. وجود سلول هاي ژرمي بخصوص سلول هاي بنيادي اسپرم ساز (SSCs) در اين كشت ها، بوسيله بررسي هاي ميكروسكوپي (شكل 1) و آناليز بيان ژن ها با روش RT-PCR (شكل 2)، تاييد شد. در ادامه سلول هاي كشت شده حاصل از بافت بيضه در محيط سه بعدي طراحي شده، كشت داده شدند. بعد از 5 هفته با روش رنگ آميزي هماتوكسيلين-ائوزين و ميكروسكوپ نوري نمونه ها مورد بررسي قرار گرفتند و سلول هاي اسپرمي شناسايي شدند. بطور كلي، حاصل اين اختراع ارائه يك سيستم بسيار ساده، تكرارپذير و كارآمد جهت توليد سلول هاي اسپرمي كاملا بالغ از لحاظ مورفولوژي از سلو لهاي بنيادي اسپرم ساز جوجه مي باشد (شكل 3).

عنوان اختراع: بيوفيلم مشتق از ماتريكس خارج سلولي غني از كلاژن عنوان لاتين اختراع: Biofilm drivede of collagen enreached extracellular matrix زمينه فني: بيوفيلم كلاژنه با استفاده از اصول مهندسي بافت و كشت سلول توليد شده است و داراي كاربردهايي در مهندسي بافت، سلول¬درماني و پزشكي ترميمي مي¬باشد. در جهت كاربرد كلينيكي سلول‌هاي بنيادي، بايد به طريقي پتانسيل تكثيري و تمايزي سلول‌هاي بنيادي را حفظ نموده و از كاهش پتانسيل تمايزي در اثر كشت بر روي سطوح پلاستيكي جلوگيري نمود بيوفيلم ساخته شده داراي خصوصيات منحصر به فردي است كه توانسته چسبندگي سلول ها را به سطح، پتانسيل تمايزي و تكثيري سلول هاي بنيادي را افزايش دهد. با توجه به اهميت حفظ تكثير و تمايز سلول هاي بنيادي در سلول درماني و پزشكي ترميمي ، استفاده از بيوفيلم هاي غني از كلاژن با تامين ريز محيط طبيعي سلول ها ميتواند منجر به افزايش بازده سلول درماني و مهندسي بافت باشد. بيوفيلم¬هاي كلاژنه حاوي كلاژن، پروتئوگليكان¬ها، گليكوپروتئين،اينتگرين و لامينين و ساير مواد موجود در ماتريكس خارج سلولي است. از آن‌جا كه مواد موجود در ماتريكس¬هاي‌ خارج سلولي طبيعي محيط‌هاي فيزيولوژيك مناسبي براي سلول بشمار مي‌آيند، بيوفيلم كلاژنه داراي كاربردهاي زير مي باشد: • استفاده به عنوان ريز محيط ايده¬آل به منظور كشت سلول¬هاي بنيادي. • استفاده به عنوان داربست در پزشكي ترميمي و مهندسي بافت¬هاي استخوان، چربي، تاندون، لثه و پوست.

استخراج وزيكول‏هاي خارج سلولي از ترشحات سلول‏هاي بنيادي و يا سرطاني كه در دهه گذشته با توجه به ويژگي‏هاي زيستي برجسته اين وزيكول‏هاي غشايي مورد توجه ويژه قرار گرفته است، نيازمند رعايت اصول و استاندراد‏هاي بين المللي مي‏باشد كه بايد ضمن مراحل كشت سلول‏هاي مولد در نظر گرفته شوند. از جمله اين اصول، كشت سلول‏ها در محيطي عاري از وزيكول‏هاي خارج سلولي با منشاء خارجي مي‏باشد. كشت سلول‏هاي بنيادي و يا سرطاني در شرايط آزمايشگاهي نياز به استفاده از مكمل‏هاي غذايي در كنار استفاده از محيط كشت پايه دارد. سرم جنيني گاو يكي از مرسوم‏ترين و در دسترس‏ترين انواع مكمل‏هاي غذايي مي‏باشد كه استفاده از آن جهت حفظ بقا و ويژگي‏هاي زيستي بسياري از سلول‏ها در شرايط كشت اجتناب ناپذير مي‏باشد. با توجه به منشاء زيستي سرم جنيني گاو، اين محلول داراي سطح بالايي از وزيكول‏هاي خارج سلولي با منشاء گاوي مي‏باشد كه هدف از اختراع حاضر حذف اين عوامل مزاحم از محيط كشت سلول‏ها با استفاده از يك محلول پليمري عاري از پاتوژن بر پايه استفاده از پلي اتيلن گليكول با وزن مولكولي و درصد مشخص در زمان كوتاه و با صرف هزينه اندك مي‏باشد. پليمر مورد استفاده در تهيه اين محلول از نظر زيستي ايمن بوده و بي‏اثر مي‏باشد. بعلاوه، روش ارائه شده در اين اختراع با توجه به شباهت سرم جنيني گاوي با سرم تهيه شده از بدن ساير حيوانات مانند اسب و يا ليز پلاكت انساني و سرم انساني قابليت تعميم به ساير موارد مشابه را داشته و بنابراين كاربرد بسيار گسترده‏اي در بخش مطالعات پايه، مطالعات پيش باليني، باليني و تشخيص و درمان زودهنگام بيماري‏ها خواهد داشت.

خلاصه اي از توصيف اختراع: در اين تحقيق داربست مشتق شده از ماتريكس خارج سلولي ECM غضروف مفصلي به عنوان داربست بعدي جهت مطالعات مهندسي بافت تهيه گرديد. براي اين كار ابتدا قطعاتي از غضروف مفصلي اپي فيز استخوان ران گاو تهيه شده و سپس با روش فريز-ذوب سريع و استفاده از شوينده سديم دودسيل سولفات SdS. بافت حاصل سلول زدايي گرديد. بررسي هاي بافت شناسي با هماتوكسيلين _ ائوزين، رنگ فلورسنت DAPI و نيز تصاوير ميكروسكوپ الكتروني اسكنينگ وجود ماتريكس فاقد سلول را نشان داد. همچنين رنگ آميزي هاي اختصامي تركيبات ECM غضروفي مانند آبي تولوئيدين، سافرانين 0 و بيكروسيروس رد حفظ تركيبات ECM را تاييد مي كرد. داربست مشتق شده از ECM غضروف مفصلي به علت تهيه از منبع طبيعي، داشتن معماري و خلل و فرج طبيعي و نيز حذف اثر آنتي ژنيك سلول هاي بافت مي تواند كاربرد وسيعي در مطالعات كشت سلولي و مهندسي بافت داشته باشد.

در اين تحقيق داربست مشتق شده از ماتريكس خارج سلولي (ECM) استخوان اسفنجي به عنوان داربست سه بعدي در مهندسي بافت، تهيه گرديد. براي اين كار ابتدا قطعاتي از استخوان اسفنجي اپي فيز استخوان ران گاو تهيه شده و سپس با روش هاي فيزيكي و شيميايي از جمله آب جوش، فريز - ذوب سريع و استفاده از شوينده سديم دودسيل سولفات ( SDS)، بافت حاصل سلول زدايي گرديد. مطالعات ماكروسكوپي نشان از خلل و فرج فراوان در بافت استخوان اسفنجي بعد از فرايند سلول زدايي مي دهد، همچنين بررسي هاي بافت شناسي با هماتوكسيلين - ائوزين و رنگ فلورسنت DAPI وجود ماتريكس فاقد سلول را نشان داد، همچنين رنگ هاي اختصاصي تركيبات ECM استخوان اسفنجي مانند پيكروفوشين و پيكروسيروس رد حفظ تركيبات ماتريكس بافت، بخصوص كلاژن را نشان داد. اين داربست به علت تهيه از منبع طبيعي، داشتن معماري و خلل و فرج طبيعي و نيز حذف اثر آنتي ژنيك سلول هاي بافت مي تواند كاربرد وسيعي در مطالعات كشت سلولي بعنوان محيطي سه بعدي و كاربردهاي مهندسي بافت داشته باشد.

اين اختراع تركيبات و سيگنال هاي لازم را به منظور القاء تمايز زدايي در سلول هاي تمايز يافته انساني فراهم مي نمايد. علاوه بر اين، پروتوكل ارائه شده در اين اختراع، يك روش سريع، آسان و كم هزينه در غربال گري تركيبات مؤثر در تكنولوژي توليد سلول هاي پرتوان القايي محسوب مي شود. اختراع كنوني نشان داد كه تركيبات حاصل از بافت در حال ترميم گوش خرگوش مي توانند به منظور القاء تمايز زدايي و بهبود ترميم استفاده گردند.

تقريبا تمام سلول‏هاي زنده (به منظور ارتباطات هر چه بيشتر) انواعي از وزيكول‏هاي خارج سلولي با نام اگزوزوم را توليد مي‎كنند كه حاوي اطلاعات سودمندي در زمينه‏هاي مختلفي هم‏چون پيشگيري، تشخيص و درمان بيماري‏ها مي‎باشند. جداسازي، خالص سازي و مطالعه دقيق اگزوزوم‎ها به واسطه اندازه كوچك‏شان (200-30 نانومتر) همواره يكي از چالش‏هاي پيش روي محققان بوده و روش‎هاي مرسوم استخراج اغلب زمانبر، طاقت فرسا، پرهزينه و با بازدهي پاييني همراه بوده است. از اين رو، دستگاهي (شكل 1) معرفي گرديده داراي دو محفظه (يك محفظه براي نمونه‏هاي زيستي و ديگري محلول شست و شوي)، با قابليت استخراج، تخليص و تغليظ اگزوزوم، كه با نيروي حاصل از فشار گاز نيتروژن طي روش مبتني بر فيلتراسيون قادر خواهد بود استخراج اگزوزوم را در حجم بالا، زمان كوتاه، بدون حضور مواد افزوزدني، به شكل خالص، پر بازده، استريل، بدون نياز به دانش/مهارت تخصصي، ارزان قيمت و در حجم دلخواه انجام دهد.Design and construction of a filtration-based device for exosome isolation from biological samples

اگزوزوم ها، دسته اي از وزيكول هاي خارج سلولي با اندازه بين 200-30 nm هستند كه نقش حياتي در ارتباطات بين سلولي ايفا مي كنند. اولين گام براي بهره گيري از كاربردهاي مختلف تحقيقاتي و باليني اگزوزوم دستيابي به نمونه خالص و سالم از آن خواهد بود. بازده و خلوص پايين، و پيچيدگي و زمان‌بر بودن فرايند استخراج در روش هاي متداول، به عنوان چالش هاي اصلي‌ در تحقيقات حوزه اگزوزوم مطرح مي شوند. ريزتراشه هاي ميكروفلوئيديك را مي توان ابزاري قدرتمند براي جداسازي اگزوزوم، بر اساس ويژگي هاي فيزيكي و يا شيميايي خاص اين نانووزيكول ها در مقياس كوچك دانست. درواقع، اصول كلي جداسازي اگزوزوم در يك ريزتراشه ميكروفلوئيديك، مشابه روش هاي سنتي مبتني بر ويژگي هاي فيزيكي و شيميايي اگزوزوم ها مي باشد، با اين تفاوت كه امكان كنترل بيشتر بر روند جداسازي و همچنين استفاده بهينه از نيروهاي خارجي (صوت، مغناطيس و ...) در ساختار اين ريزتراشه ها، موجب افزايش دقت، كارايي و بازده فرايند مي گردد. سيستم ميكروفلوئيديك پيشنهادشده، با بهره گيري از ذرات پلي اتيلن گلايكول مغناطيسي در بستر ميدان مغناطيسي خارجي، قادر به جداسازي و تخليص اين نانووزيكول ها خواهد بود. در بخش اول ريزتراشه، PEG مغناطيسي با تشكيل شبكه اطراف اگزوزوم ها (پگيله شدن) امكان جداسازي آن‌ها را در حين عبور از ميكروكانال هاي ريزتراشه، در حضور يك ميدان مغناطيسي خارجي، فراهم خواهد آورد و در بخش دوم، پس از شكسته شدن شبكه PEG-Exosome تخليص اگزوزوم و حذف ذرات PEG افزوده شده صورت خواهد پذيرفت.